En biochimie avec le spectrophotomètre il existe deux principales méthodes de dosage :
- La méthode colorimétrique : (la plus ancienne)
Cette méthode est basée sur l’intensité de coloration des substances à doser ou des paramètres à doser .La lecture se fait par densitométrie optique .La densité optique (D.O) de la préparation est en rapport étroit avec la concentration du paramètre à doser.
- La méthode cinétique : (tendance actuelle)
Elle est basée sur le temps de réaction en terme de disparition ou d’apparition des paramètres ou des substances ou leur dérivés dans le milieu réactionnel.
• Lecture de densité optique :
Elle respecte deux valeurs :
- la méthode de lecture (colorimétrique ou cinétique)
- la longueur d’onde de lecture : toute lecture de densité optique respecte scrupuleusement ces deux valeurs, la longueur d’onde traduit le spectre lumineux. La lecture doit imposer une programmation préalable des valeurs précitées.
NB : Hormis ces deux valeurs la programmation doit tenir compte de l’unité de lecture.
Ex : ui/l ; ui/ml ; g/l ; g/dl ; mg/l ; mg/dl ; mol/l ; mmol/l
NB : Les consommables sont des réactifs et des matériels à usage unique ou limité.
1-2-1 Réactif de glucose
Le réactif de glucose sert à doser la glycémie qui est le taux de sucre dans le sang qui varie entre 0.60 g/l et 1.1 g/l . En dessous de 0.60g/l on parle d’hypoglycémie, au-delà de 1.20 g/l on parle d’hyperglycémie, on parlera de diabète confirmé quand le taux avoisine 1.8 g/l.
La glycémie est le paramètre indiquant le diabète.
La glucosurie : C’est le taux de sucre dans les urines. Normalement une urine est à 0 g de glucose par litre. La glucosurie se dose généralement de manière qualitative et semi quantitative par chimie sèche (bandelettes).
Il existe une corrélation entre la glycémie et la glycosurie. Cette corrélation est régie par le seuil rénal du glucose .D’après l’étude faite par Renaud à Bethesda et à l’Institut National de santé Publique (INSP) en 2006 le seuil rénal trouvé dans le cadre de son rapport de stage est de 1.91 g/l .
Le seuil rénal est le taux de sucre au niveau du sang au-delà duquel les reins le laissent passer dans les urines.
En conclusion seul les diabétiques peuvent avoir du glucose dans leurs urines. Les bandelettes permettent de dépister les diabétiques.
I-2-1-1 Présentation du réactif :
Ces réactifs se présentent en trois (3) éléments dans des différents flacons :
- l’étalon : c’est un réactif qui sert de calibreur à l’appareil de dosage (spectrophotomètre).Il est en général présenté en petit flacon d’environ 5 à 10ml.
- Le glucose base : c’est le réactif mère servant à la préparation de la solution de travail.
- le substrat chromogène : c’est en quelque sorte l’activateur du réactif base, il se mélange au réactif base pour obtenir la solution de travail. C’est à partir de la solution de travail que le technicien peut faire le dosage.
I-2-1-2 les conditionnements des réactifs
On entend par conditionnement les différentes formes de présentation de colis ou du coffret de réactif de glucose.
Il existe plusieurs conditionnements selon les laboratoires fabricants.
• Substrat lyophilisé :
Dans le cas de substrat lyophilisé, pour travailler une reconstitution s’impose. En général le substrat est reconstitué par ajout d’eau distillée. Alors la solution de travail s’obtiendra par mélange proportionné du substrat reconstitué et de la solution de base.
Cette forme de présentation est celle qui est de conservation facile car le lyophilisat est stable jusqu'à la date de péremption marquée sur le coffret. Le réactif base n’étant pas activé est lui aussi stable jusqu'à la date de péremption marqué sur le coffret.
•Substrat en solution :
La solution de travail n’est obtenue que par mélange proportionné.
I-2-1-2b Etalon, glucose prêt à l’emploi (solution de travail)
I-3 Les méthodes de lecture :
Il existe deux (2) méthodes de lecture :
- la méthode colorimétrique
- la méthode cinétique
NB : Pour la méthode cinétique il peut ne pas avoir d’étalon.
• Caractéristiques à connaître :
- longueur d’onde de lecture
- la méthode de lecture
- les conditions de conservation
- réactif non reconstitué
- réactif reconstitué
• Matériels complémentaires à fournir :
- tubes à hémolyse pour prélèvement
- tube à hémolyse pour dosage
- embouts ou cônes propres et non obstrués (non bouchés)
- pipette calibrée réglable
- papier thermal.
• Conditions de conservation :
Les conditions de conservation d’un produit sont des mesures, des dispositions à prendre pour garantir sa stabilité. Il existe deux formes de réactifs : la forme non reconstituée et la forme reconstituée (activation du réactif base)
La forme non reconstituée respecte la date de péremption si elle est conservée dans les conditions décrites dans la notice c'est-à-dire faut pas qu’il y ait rupture de la chaine de froid et pour certains réactifs il ne faut pas les exposer à la lumière.
Pour la forme reconstituée la stabilité est fonction de la nature du réactif et doit respecter obligatoirement l’intervalle de temps indiqué dans la notice.
Ex : Un réactif de glucose à pour température de conservation 2 à 8°C ,sa date de péremption est de Juin 2009 ,sa date de fabrication est de Juin 2006, son intervalle de stabilité est de trois ans. Une fois reconstitué s’il demeure dans un bocal sombre entre 2 et 8°c, il est stable pour 30 jours. Sa qualité de validité doit se remarquer par l’absence de couleur.
I-2-2 Le réactif de cholestérol
Le réactif de cholestérol respecte à un degré moins les mêmes caractéristiques que le glucose. Cependant une fois le réactif reconstitué ,pour l’exemple que nous avons s’il est conservé dans une bouteille ou un bocal sombre à la température entre 2 et 8°c. Sa stabilité est de 60 jours.
Le cholestérol est l’expression de la matière grasse dans le sang, on le retrouve au niveau de la bile et des tissus du cerveau. C’est un précurseur à l’acide biliaire ou au stéroïde et à la vitamine D.
Son dosage dans le sérum est d’un apport appréciable dans le diagnostic d’excès de graisse et dans la classification de la lipidémie (lipides = graisse). D’autres conditions telles que les maladies hépato thyroïdiennes influencent le taux de cholestérol. Le taux normal de cholestérol ou cholestérolémie est de 1,5 à 2,8g/l. Il existe d’autres types de lipides : les triglycérides et des fractionnements du cholestérol total qui sont : HDL cholestérol (High Density Liprotein) : LDL (Low Density Liprotein).Le mauvais cholestérol est le LDL.
Les taux normaux de ces différent lipides sont : - HDL (0,2 –0,4 g/l)
- Triglycerides < 1.6g/l
- LDL < 2.5g/l
NB: Le coffret HDL cholestérol doit contenir obligatoirement une solution de précipitation et un étalon ou standard.
I-2-3 Urée :
C’est un paramètre biochimique servant à l’exploration des reins, permettant le diagnostic de la goutte.
L’élévation du taux de l’urée dans le sang n’indique forcement pas une insuffisance rénale. Des examens complémentaires pourront permettre la confirmation d’une insuffisance rénale.
Le taux normal de l’urée dans le sang ou urémie varie entre 0.15 g/l et 0.50g/l.
Le conditionnement et les conditions de conservation sont à un degré moindre identiques à ceux du glucose.
NB : Nous avons de plus en plus le dosage de l’urée par la méthode cinétique.
I-2-4 L’acide urique :
C’est un paramètre biochimique qui est un métabolite de la purine. Presque la moitié de l’acide urique total est éliminée et remplacée chaque jour par voie urinaire et à travers la dégradation microbienne au niveau intestinal.
L’élévation du taux d’acide urique est un indicateur du diagnostic de la goutte mais alors il faut qu’il soit associé à la rétention de nitrogène, de l’urée, de la créatinine, et d’autres constituants non protéiques.
A part la goutte il peut être indicateur du mauvais fonctionnement du rein, il peut indiquer aussi un problème myoloprolifératif (leucémie).
Il existe aussi d’autres circonstances d’élévation du taux de l’acide urique non élucidés.
Le taux normal d’acide urique dans le sang ou uricémie est de 30 à 70 mg/l. On parlera d’hyperuricémie quand le taux d’acide urique dépassera 70mg/l.
I-2-5 La créatinine :
C’est un paramètre biochimique permettant d’explorer le rein et les voies urinaires. Il est plus sensible que l’urée c’est-à-dire son taux augmente de manière exponentielle pour les moindres troubles des voies urinaires et du rein, la créatinine peut aussi s’élever après consommation de certains aliments et surtout après consommation de médicaments traditionnels. Le taux de créatinine ou créatininemie varie entre 06 mg/l et 13,6 mg/l. Il explore la clairance du rein. Dans les infections urinaires on remarque une élévation sensible variant entre 15 et 20 mg/l.
Dans les insuffisances rénales la variation est de 50 mg/l à plus de 100 mg/l. Dans ce cas on effectue des examens complémentaires à savoir l’urémie (0,7 – 2g/l), l’uricémie (+100 mg/l) les phosphatases alcalines élevées, dans cette situation nous parlons d’insuffisance rénale.
I-2-6 Les transaminases :
Les transaminases sont des paramètres biochimiques permettant d’explorer le foie et quelques peu le cœur.
Les transaminases sont de deux types :
• L’asparate amino transferas (ASAT) ou Transaminases Glutamo
oxalo acétique (TGO)
Ce type de transaminases à un taux inférieur à 37ui/l. c’est une enzyme, un catalyseur de réaction biologique interne. Il est retrouvé dans les tissus principalement les tissus cardiaques, hépatiques, musculaires et rénaux.
Un dommage ou une inflammation de ces tissus conduit à l’élévation du taux de ces transaminases. dans le sang circulant.
Ainsi dans l’infarctus du myocarde (cause de crise cardiaque) le taux sérique (taux dans le sérum) de TGO ou ASAT atteint un pique en 48 – 60 heures après la crise.
Les maladies hépatobiliaires telles que les cirrhoses, les carcinomes métastasiques (cancer) et les hépatites virales sont aussi les causes d’élévation du taux.
Le premier examen de ASAT a été décrit par Karmen et alliés en 1955.
C’est Henri et alliés qui ont évalué de manière optimale en 1960 cette analyse.
En 1977, la fédération de chimiclinique internationale (Biochimie) recommandait comme référence la procédure de dosage de l’ASAT selon Karmen.
• ALAT (Alanine amino transférase) ou TGP (Transaminases
Glutamo Pyruvate
C’est une enzyme qui est abondamment trouvée dans le foie il est donc indiqué dans son exploration. Cependant on peut trouver un taux élevé suite à un infarctus du myocarde. Le taux normal est inférieur à 40ui/l.
•Conditionnement et conservation :
Que ce soit la créatinine ou les transaminases, paramètres utilisant pour la plupart du temps la méthode cinétique, ils sont conditionnés en deux flacons à savoir le réactif base et le substrat chromogène, il peut cependant avoir un flacon d’étalon.
Le réactif non reconstitué se conserve entre 2 et 8°c jusqu’à la date de péremption indiquée sur le coffret. Une fois reconstitué, le réactif est stable pour 8 heures à la température de 15 à 30° et 21 jours quand il est réfrigéré immédiatement.
I-2-7 Le magnésium :
C’est un paramètre biochimique, c’est un sel minéral de nature, il est sous forme d’ion (cation). Le taux normal varie entre 16 et 28mg/l. sa carence provoque des malaises multiples : crampes, douleurs cervicales, tremblement, des céphalées….
La source d’approvisionnement de l’organisme est l’alimentation.(eau,feuilles vertes…). Il joue un rôle de catalyseur de réactions biologiques et entre dans la composition de beaucoup de protéines ou substances enzymatiques.
I-2-8 Le sodium :
Il est un sel qui est utilisé par l’organisme sous la forme de cation (Na+). Il rentre dans la composition de beaucoup de produits biologiques, il joue un rôle important au niveau du système nerveux. Couplé au potassium, il sert d’élément de conduction de l’influx nerveux. Le sodium est cause d’hypertension artérielle. Le sodium est un élément important de l’ionogramme sanguin, actuellement l’ionogramme se limite au taux de sodium et au taux de potassium.
Cet examen entre dans le bilan d’hypertension, dans le bilan rénal et dans le bilan cardiaque.
Le sodium s’exprime en eq.g/l. Le taux normal de sodium dans le sérum est de 140 meq/l à 155 meq/l.
Tout simplement, le sodium étant un oxydant, intervient surtout dans les échanges d’électrons entre ions d’où son dosage par rapport à sa charge électronique
9 – Le potassium :
Tout comme le Sodium, le Potassium est un sel qui se trouve dans tous les liquides sous formes de cations et joue un rôle couplé avec le sodium. Son unité de dosage est l’équivalent gramme. Le taux normal de Potassium dans le sérum est de 3,9 meq/l à 5,5 meq/l.
L’ionogramme sanguin est le taux de Potassium, de Sodium et de Chlore.
Le taux normal de chlore est 95 – 102 meq/l
103 [Na+]
NB : Calcul du chlore : [Cl] =
143
LES BASES D’APPRECIATION D’UN REACTIF
1 - Les critères de choix d’un réactif
Ils sont basés sur :
- la sensibilité du réactif
- la spécificité du réactif
- la stabilité du réactif
- la fiabilité du réactif
2- Les critères de résolution du choix d’un réactif
Les critères de résolution pour les délégués sont :
- la mobilité du stock du réactif
- la facilité d’exécution des tests (le test doit être peu exigeant, ne demandant pas assez de moyens techniques.) (1)
Pour les techniciens
il doit être adapté à leur laboratoire (conditionnement) en plus du critère (1)
VII Performance d’un réactif
La performance d’un réactif se calcule en choisissant un réactif comme référence : c’est-à-dire un réactif de même nature et connu pour ses bons résultats.
Un minimum d’analyses doit être fait sur un panel de 100 échantillons pour permettre de calculer de manière numérique les critères de choix.
Calcul des performances d’un réactif:
1 Nn
• Sensibilité : S = avec is =
1 + is Np + Nc
is : gradient d’insensibilité (is < 1)
Np : nombre de tests donnant le même résultat que le référentiel.
Nn : Nombre de tests ne donnant pas les mêmes résultats que le test référentiel
Nc : Nombre corrompu : nombre de tests donnant approximativement le même résultat que le référentiel.
Exemple : Np = 5 ; Nn = 2 ; Nc = 3
S = 80%
Np
• Spécificité : Sp = S x
Np + Nc
1 NE
• Stabilité : St = avec ist =
1 + ist NS
Ist : gradient d’instabilité (ist< 1)
NE : nombre de test n’ayant pas réagi à la date de péremption
NS : nombre de test ayant réagi à la date péremption
Le WIDAL & FELIX est un test sérologique rapide, sur plaque et en tube :
PRINCIPE
Conditionnement d’une réaction antigène- anticorps visible à l’œil nu grâce à la combinaison préalable anticorps particules. La réaction est perçue sous forme d’agglutinats. C’est un test très sensible mais spécifique à 50- 80% .Il est constitué de deux types d’antigènes :
- Antigène somatique O (antigène de paroi)
- Antigène flagellaire H (antigène de flagelle)
Dans l’ordre d’apparition des anticorps après contage, les anticorps anti-antigènes somatiques O sont les premiers à apparaître, ensuite, les anticorps anti-antigènes flagellaires H apparaissent
L’ordre d’apparition des anticorps permet de faire une interprétation des résultats.
Les tests de WIDAL & FELIX rapides sont des tests à conservation facile, (peuvent rester plus d’un mois mais à la température du laboratoire sans être détériorés). Comme tout test d’agglutination, il peut être sensible aux secousses.
L’homogénéisation doit se faire par retournements doux.
Présentation du test : 8 tests sérologiques +2 tests de contrôle (- /+)
conditionnalités de réalisation des tests
Toute induction d’anticorps respecte un moment d’incubation. La progressivité de cette induction, rallonge la période de détectabilité des anticorps.
Ainsi, le WIDAL & FELIX est négatif dans la première semaine du contage.
Anticorps anti salmonelle Période de l’apparition d’anticorps Pic d’anticorps Titre significatif
AO, BO, CO
T O
D
1- 2 semaines
3-5 semaines
1 / 100
AH , BH , CH
TH , HD
2-3 semaines
4-5 semaines
1/200
Les plaques et les tubes de réactions doivent être secs et propres pour éviter les
fausses réactions. Il n’est pas conseillé d’utiliser le WIDAL & FELIX pour les contrôles après traitement. A cause du mémoire immunologique, les résultats après traitement sont ininterprétables. Les tests ne doivent pas être réalisés sur du sérum hémolysé pour éviter les fausses réactions, en général les réactions sont inhibées dans le cas des sérums hémolysés.
Tous les résultats positifs doivent être testés par la technique en tube.
Utilisation des réactifs
Après environ 30mn à la température du laboratoire, les réactifs peuvent être utilisés après suspension par retournements doux.
Micro titrage sur plaque
C’est une technique délicate qui demande une maîtrise spéciale.
On distribue le diluant sur la plaque, on procède par dilutions progressives du sérum en partant de la première goutte de diluant à la dernière.
Cette première série de dilutions permettra de déterminer le titre brut. Ce titre est l’inverse de la dernière dilution donnant une agglutination.
Le titre définitif est donné par le produit du titre brut par le seuil de positivité
Ex : soit 1/16 la dernière dilution donnant une agglutination après ajout du réactif
T : 16
Soit S : 20 ui /ml, seuil de positivité du réactif inscrit sur la boîte ou dans la notice.
Tf : 20x16 : 320 ui /ml
Dans le cas du WIDAL TECO, on fera une agglutination sur plaque pour le test qualitatif.
Le test quantitatif est fait par dilution en tubes.
Procédure
Micro titrage sur plaque
1-Mettre une série de gouttes d’environ 50ul de diluant sur la plaque.
2- Ajouter 50ul de sérum à la première goutte.
3- Homogénéiser par pipetage et prélever 50ul pour la goutte de diluant suivante, répéter le geste jusqu’à la fin des gouttes et rejeter 50ul.
Les dilutions obtenues sont : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128….
On testera chaque dilution par apport de réactif dans le milieu réactionnel.
On déterminera le titre brut puis le titre définitif.
Titrage sur plaque
50 ul 50 ul 50 ul 50 ul
Diluant : 50ml 50ul 50 ul 50 ul
Dilution : 1/2 1/4 1/8 1/1
Titre brut 2 4 8 16
Titre définitif: 2.S 4.S 8.S 16.S
NB- Le titre brut est l’inverse du taux de dilution ayant réagi.
Le titre définitif est le produit du seuil par le titre brut.
Micro titrage en tubes
Procédure :
Les dilutions successives et progressives se font dans des tubes à hémolyse.
Selon le test, on définira une dilution de départ. A partir de cette dilution, on procédera par des dilutions progressives. Au niveau de la dilution en tube, il n’existe pas de titre définitif, vu l’importance des dilutions la solution réactive ne les modifie pas.
Le titre brut est le seul à noter.
Voir fiches techniques ou fiches de résultats.
Observations : on notera toutes les remarques : hémolyse, insuffisance de sérum, sérum vieilli (+2 jours au réfrigérateur)
FICHE DE COMMANDE CLIENT
Etablissement : Date de commande :
Adresse : Date limite de recevabilité :
Service :
Paillasse :
Code Qtité Désignation Condition-
nement Méthode Long
D’onde Observation
TECHNICIEN RESPONSABLE DE LABORATOIRE
FICHE DE RENSEIGNEMENT ENTREPRISE
Etablissement : Date :
Adresse : Type d’appareil :
Service :
Paillasse
N° DESIGNATION METHODE CODE CONDITI Long
D’onde
lecture OBSERV
TECHNICIEN INVESTIGATEUR
FICHE DE LIVRAISON ENTREPRISE
Etablissement : Date de livraison :
Adresse : Date limite de paiement :
Service :
Paillasse :
N° Code Qtité Désignation Date de
pérempt Prix
Unit Mtant Observ
Total :
Client Entreprise Date
3
ouafia
Le 16/05/2010
salut ,je veux savoir comment calculer l'ALAT ET l'ASAT ,,????????
EST CE QUE cette methode est juste: A2-A1=x
A3-A2=y X+Y=B B fois 1750=?
JE LIs A1.A2.A3 apres a intervalle de 3 min
4
Tiemele
Le 18/05/2010
M. Ouafia, il serait plus interessant que vous vous presentiez encore plus. Nous apprecions cependant votre confiance. Nous vous prions de bienvouloir etre plus explicite. Merci
5
DAGUIA John Clotaire
Le 10/06/2010
je suis en master2 de biochimie en Centrafrique(RCA), je voudrais seulement avoir de connaissance aux techniques de laboratoire, c'est pourquoi je suis tombé sur votre site; merci et à très bientôt
6
ONDENOT
Le 23/06/2010
j'aimerais savoir s'il existe un procédé de contrôle interne ou une contre épreuve pour le test de Widal et Felix à l'image du groupage sanguin(épreuve globulaire et épreuve sérique qui doivent être compatible afin d'être sur du groupe sanguin)?
7
kouame tiemele
Le 26/06/2010
merci ADENOT pour votre confiance.
concernant l'epreuve de Widal en test rapid sur plaque, la contre epreuve ou de confirmation doit se faire en tubes. la coproculture pourrait etre un tres bon test de contre epreuve puisqu'il resoud le probleme de fenetre d'incubation se situant avant la premiere semaine de contage infectieux. merci, votre serviteur Tiemele Kouame
8
TALLA CLOVIS
Le 28/06/2010
salut je suis etudiant en licence 3 de biochimie je voudrais que vous me parliez de la notion de management et de control de qualite car je n'y comprend rien
9
TIEMELE
Le 13/07/2010
M. TALLA, comprenez simplement que le Management de la Qualite ou par la Qualite est un ensemble de techniques ou processus mis en oeuvre pour la Gestion ou l'Administration des procedures techniques, administratives et du personnel technique pour assurer la satisfaction des beneficiaires des prestations du laboratoire.
Le control de la Qualite est un systeme valide par un service competent permettant de s'assuerer de la conformite des resultats delivres.
10
foku aimé
Le 18/01/2011
cmt gars
11
lubaki
Le 04/11/2011
je veux connaitre le condition qu'on peut faire le test de salmonelle
12
razak
Le 02/02/2012
jevoudrais avoir le protocol complet pour le dosage des enzymes et substrat avec un spectro
A M. Lubaki: les tests de salmonelle se fait lorsque le sujet fait une fièvreavec ou non une insomnie et des céphalées. Le test doit se faire sur un serum non hémolysé s'il s'agit du Widal et Félix.
On peut également faire une coprocuture sur milieu SS.
A M. Razak, les protocoles de dosage des enzymes sont fournis par les fabricants des réactifs. On les trouve dans les coffrets.
14
mireille kapinga
Le 08/05/2012
beaucoup savoir sur le widal
15
Tiemele Kouame
Le 18/06/2012
Le Widal est un test serologique permettant de rechercher dans le sang d'un patient deux types d'anticorps.
- les anticorps somatiques O qui apparaissent environ une semaine apres le comtage. Ils sont de type Igm et disparaissent quelques semaines sans ou avec traitement
- les anticorps flagellaires qui apparaissent deux semaines environ apres le comptage. Ils sont de type IgG. Ce sont des anticorps memoire. Ils peuvent apparaitre apres une vaccination. Ils persistent apres traitement d'un malade. l'interpretation du Widal est delicate. Il n'est pas indiqué dans les controles apres traitements. Les resultats sont ininterpretables apres traitement.
16
badaoui walid
Le 01/08/2012
Je veux apprendre les applications de tests sanguins manuellement avec déferrent réactif .
17
DJONA LONA
Le 16/08/2012
bonjour et merci de se donner a la sante .je suis un camerounais .quelle est la méthode la plus fiable entre la plaque et en tube
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66
mohamed
Le 30/10/2012
salem saha eidkom
je veux savoir comment est ce que en peut utilise tube sec pour touts les test biochimique et sérologiques
pourqoi en centrifugue le prélevement rapidement juste après on reçu
merci
67
tiemele
Le 27/11/2012
Le test le plus fiable est le test en tubes. Cependant il est plus fastidieux et plus couteux
68
tiemele
Le 27/11/2012
Les tests en tubes sont plus fiables mais fastidieux, plus couteux. Tres bon pour les confirmations.
69
Tiemele
Le 19/12/2012
Djona, la methode la plus fiable est celle en tube c'est pour cela qu'elle est utilisee pour les confirmations,
70
Tiemele
Le 23/01/2013
le test le plus fiable est celui fait en tube. Il sert d'ailleurs de test de confirmation des tests positifs sur plaque. Merci
Commentaires
1 kouame Tiemele Le 29/03/2009
LES CONSOMMABLES AU LABORATOIRE
I Les consommables au laboratoire de BIOCHIMIE
I-1 Matériels :
(Voir cours précédents)
I- 2 Réactifs :
Méthodes de dosage :
En biochimie avec le spectrophotomètre il existe deux principales méthodes de dosage :
- La méthode colorimétrique : (la plus ancienne)
Cette méthode est basée sur l’intensité de coloration des substances à doser ou des paramètres à doser .La lecture se fait par densitométrie optique .La densité optique (D.O) de la préparation est en rapport étroit avec la concentration du paramètre à doser.
- La méthode cinétique : (tendance actuelle)
Elle est basée sur le temps de réaction en terme de disparition ou d’apparition des paramètres ou des substances ou leur dérivés dans le milieu réactionnel.
• Lecture de densité optique :
Elle respecte deux valeurs :
- la méthode de lecture (colorimétrique ou cinétique)
- la longueur d’onde de lecture : toute lecture de densité optique respecte scrupuleusement ces deux valeurs, la longueur d’onde traduit le spectre lumineux. La lecture doit imposer une programmation préalable des valeurs précitées.
NB : Hormis ces deux valeurs la programmation doit tenir compte de l’unité de lecture.
Ex : ui/l ; ui/ml ; g/l ; g/dl ; mg/l ; mg/dl ; mol/l ; mmol/l
NB : Les consommables sont des réactifs et des matériels à usage unique ou limité.
1-2-1 Réactif de glucose
Le réactif de glucose sert à doser la glycémie qui est le taux de sucre dans le sang qui varie entre 0.60 g/l et 1.1 g/l . En dessous de 0.60g/l on parle d’hypoglycémie, au-delà de 1.20 g/l on parle d’hyperglycémie, on parlera de diabète confirmé quand le taux avoisine 1.8 g/l.
La glycémie est le paramètre indiquant le diabète.
La glucosurie : C’est le taux de sucre dans les urines. Normalement une urine est à 0 g de glucose par litre. La glucosurie se dose généralement de manière qualitative et semi quantitative par chimie sèche (bandelettes).
Il existe une corrélation entre la glycémie et la glycosurie. Cette corrélation est régie par le seuil rénal du glucose .D’après l’étude faite par Renaud à Bethesda et à l’Institut National de santé Publique (INSP) en 2006 le seuil rénal trouvé dans le cadre de son rapport de stage est de 1.91 g/l .
Le seuil rénal est le taux de sucre au niveau du sang au-delà duquel les reins le laissent passer dans les urines.
En conclusion seul les diabétiques peuvent avoir du glucose dans leurs urines. Les bandelettes permettent de dépister les diabétiques.
I-2-1-1 Présentation du réactif :
Ces réactifs se présentent en trois (3) éléments dans des différents flacons :
- l’étalon : c’est un réactif qui sert de calibreur à l’appareil de dosage (spectrophotomètre).Il est en général présenté en petit flacon d’environ 5 à 10ml.
- Le glucose base : c’est le réactif mère servant à la préparation de la solution de travail.
- le substrat chromogène : c’est en quelque sorte l’activateur du réactif base, il se mélange au réactif base pour obtenir la solution de travail. C’est à partir de la solution de travail que le technicien peut faire le dosage.
I-2-1-2 les conditionnements des réactifs
On entend par conditionnement les différentes formes de présentation de colis ou du coffret de réactif de glucose.
Il existe plusieurs conditionnements selon les laboratoires fabricants.
I-2-1-2a Etalon (standard), glucose base, substrat
• Substrat lyophilisé :
Dans le cas de substrat lyophilisé, pour travailler une reconstitution s’impose. En général le substrat est reconstitué par ajout d’eau distillée. Alors la solution de travail s’obtiendra par mélange proportionné du substrat reconstitué et de la solution de base.
Cette forme de présentation est celle qui est de conservation facile car le lyophilisat est stable jusqu'à la date de péremption marquée sur le coffret. Le réactif base n’étant pas activé est lui aussi stable jusqu'à la date de péremption marqué sur le coffret.
•Substrat en solution :
La solution de travail n’est obtenue que par mélange proportionné.
I-2-1-2b Etalon, glucose prêt à l’emploi (solution de travail)
I-3 Les méthodes de lecture :
Il existe deux (2) méthodes de lecture :
- la méthode colorimétrique
- la méthode cinétique
NB : Pour la méthode cinétique il peut ne pas avoir d’étalon.
• Caractéristiques à connaître :
- longueur d’onde de lecture
- la méthode de lecture
- les conditions de conservation
- réactif non reconstitué
- réactif reconstitué
• Matériels complémentaires à fournir :
- tubes à hémolyse pour prélèvement
- tube à hémolyse pour dosage
- embouts ou cônes propres et non obstrués (non bouchés)
- pipette calibrée réglable
- papier thermal.
• Conditions de conservation :
Les conditions de conservation d’un produit sont des mesures, des dispositions à prendre pour garantir sa stabilité. Il existe deux formes de réactifs : la forme non reconstituée et la forme reconstituée (activation du réactif base)
La forme non reconstituée respecte la date de péremption si elle est conservée dans les conditions décrites dans la notice c'est-à-dire faut pas qu’il y ait rupture de la chaine de froid et pour certains réactifs il ne faut pas les exposer à la lumière.
Pour la forme reconstituée la stabilité est fonction de la nature du réactif et doit respecter obligatoirement l’intervalle de temps indiqué dans la notice.
Ex : Un réactif de glucose à pour température de conservation 2 à 8°C ,sa date de péremption est de Juin 2009 ,sa date de fabrication est de Juin 2006, son intervalle de stabilité est de trois ans. Une fois reconstitué s’il demeure dans un bocal sombre entre 2 et 8°c, il est stable pour 30 jours. Sa qualité de validité doit se remarquer par l’absence de couleur.
I-2-2 Le réactif de cholestérol
Le réactif de cholestérol respecte à un degré moins les mêmes caractéristiques que le glucose. Cependant une fois le réactif reconstitué ,pour l’exemple que nous avons s’il est conservé dans une bouteille ou un bocal sombre à la température entre 2 et 8°c. Sa stabilité est de 60 jours.
Le cholestérol est l’expression de la matière grasse dans le sang, on le retrouve au niveau de la bile et des tissus du cerveau. C’est un précurseur à l’acide biliaire ou au stéroïde et à la vitamine D.
Son dosage dans le sérum est d’un apport appréciable dans le diagnostic d’excès de graisse et dans la classification de la lipidémie (lipides = graisse). D’autres conditions telles que les maladies hépato thyroïdiennes influencent le taux de cholestérol. Le taux normal de cholestérol ou cholestérolémie est de 1,5 à 2,8g/l. Il existe d’autres types de lipides : les triglycérides et des fractionnements du cholestérol total qui sont : HDL cholestérol (High Density Liprotein) : LDL (Low Density Liprotein).Le mauvais cholestérol est le LDL.
Les taux normaux de ces différent lipides sont : - HDL (0,2 –0,4 g/l)
- Triglycerides < 1.6g/l
- LDL < 2.5g/l
NB: Le coffret HDL cholestérol doit contenir obligatoirement une solution de précipitation et un étalon ou standard.
I-2-3 Urée :
C’est un paramètre biochimique servant à l’exploration des reins, permettant le diagnostic de la goutte.
L’élévation du taux de l’urée dans le sang n’indique forcement pas une insuffisance rénale. Des examens complémentaires pourront permettre la confirmation d’une insuffisance rénale.
Le taux normal de l’urée dans le sang ou urémie varie entre 0.15 g/l et 0.50g/l.
Le conditionnement et les conditions de conservation sont à un degré moindre identiques à ceux du glucose.
NB : Nous avons de plus en plus le dosage de l’urée par la méthode cinétique.
I-2-4 L’acide urique :
C’est un paramètre biochimique qui est un métabolite de la purine. Presque la moitié de l’acide urique total est éliminée et remplacée chaque jour par voie urinaire et à travers la dégradation microbienne au niveau intestinal.
L’élévation du taux d’acide urique est un indicateur du diagnostic de la goutte mais alors il faut qu’il soit associé à la rétention de nitrogène, de l’urée, de la créatinine, et d’autres constituants non protéiques.
A part la goutte il peut être indicateur du mauvais fonctionnement du rein, il peut indiquer aussi un problème myoloprolifératif (leucémie).
Il existe aussi d’autres circonstances d’élévation du taux de l’acide urique non élucidés.
Le taux normal d’acide urique dans le sang ou uricémie est de 30 à 70 mg/l. On parlera d’hyperuricémie quand le taux d’acide urique dépassera 70mg/l.
I-2-5 La créatinine :
C’est un paramètre biochimique permettant d’explorer le rein et les voies urinaires. Il est plus sensible que l’urée c’est-à-dire son taux augmente de manière exponentielle pour les moindres troubles des voies urinaires et du rein, la créatinine peut aussi s’élever après consommation de certains aliments et surtout après consommation de médicaments traditionnels. Le taux de créatinine ou créatininemie varie entre 06 mg/l et 13,6 mg/l. Il explore la clairance du rein. Dans les infections urinaires on remarque une élévation sensible variant entre 15 et 20 mg/l.
Dans les insuffisances rénales la variation est de 50 mg/l à plus de 100 mg/l. Dans ce cas on effectue des examens complémentaires à savoir l’urémie (0,7 – 2g/l), l’uricémie (+100 mg/l) les phosphatases alcalines élevées, dans cette situation nous parlons d’insuffisance rénale.
I-2-6 Les transaminases :
Les transaminases sont des paramètres biochimiques permettant d’explorer le foie et quelques peu le cœur.
Les transaminases sont de deux types :
• L’asparate amino transferas (ASAT) ou Transaminases Glutamo
oxalo acétique (TGO)
Ce type de transaminases à un taux inférieur à 37ui/l. c’est une enzyme, un catalyseur de réaction biologique interne. Il est retrouvé dans les tissus principalement les tissus cardiaques, hépatiques, musculaires et rénaux.
Un dommage ou une inflammation de ces tissus conduit à l’élévation du taux de ces transaminases. dans le sang circulant.
Ainsi dans l’infarctus du myocarde (cause de crise cardiaque) le taux sérique (taux dans le sérum) de TGO ou ASAT atteint un pique en 48 – 60 heures après la crise.
Les maladies hépatobiliaires telles que les cirrhoses, les carcinomes métastasiques (cancer) et les hépatites virales sont aussi les causes d’élévation du taux.
Le premier examen de ASAT a été décrit par Karmen et alliés en 1955.
C’est Henri et alliés qui ont évalué de manière optimale en 1960 cette analyse.
En 1977, la fédération de chimiclinique internationale (Biochimie) recommandait comme référence la procédure de dosage de l’ASAT selon Karmen.
• ALAT (Alanine amino transférase) ou TGP (Transaminases
Glutamo Pyruvate
C’est une enzyme qui est abondamment trouvée dans le foie il est donc indiqué dans son exploration. Cependant on peut trouver un taux élevé suite à un infarctus du myocarde. Le taux normal est inférieur à 40ui/l.
•Conditionnement et conservation :
Que ce soit la créatinine ou les transaminases, paramètres utilisant pour la plupart du temps la méthode cinétique, ils sont conditionnés en deux flacons à savoir le réactif base et le substrat chromogène, il peut cependant avoir un flacon d’étalon.
Le réactif non reconstitué se conserve entre 2 et 8°c jusqu’à la date de péremption indiquée sur le coffret. Une fois reconstitué, le réactif est stable pour 8 heures à la température de 15 à 30° et 21 jours quand il est réfrigéré immédiatement.
I-2-7 Le magnésium :
C’est un paramètre biochimique, c’est un sel minéral de nature, il est sous forme d’ion (cation). Le taux normal varie entre 16 et 28mg/l. sa carence provoque des malaises multiples : crampes, douleurs cervicales, tremblement, des céphalées….
La source d’approvisionnement de l’organisme est l’alimentation.(eau,feuilles vertes…). Il joue un rôle de catalyseur de réactions biologiques et entre dans la composition de beaucoup de protéines ou substances enzymatiques.
I-2-8 Le sodium :
Il est un sel qui est utilisé par l’organisme sous la forme de cation (Na+). Il rentre dans la composition de beaucoup de produits biologiques, il joue un rôle important au niveau du système nerveux. Couplé au potassium, il sert d’élément de conduction de l’influx nerveux. Le sodium est cause d’hypertension artérielle. Le sodium est un élément important de l’ionogramme sanguin, actuellement l’ionogramme se limite au taux de sodium et au taux de potassium.
Cet examen entre dans le bilan d’hypertension, dans le bilan rénal et dans le bilan cardiaque.
Le sodium s’exprime en eq.g/l. Le taux normal de sodium dans le sérum est de 140 meq/l à 155 meq/l.
Tout simplement, le sodium étant un oxydant, intervient surtout dans les échanges d’électrons entre ions d’où son dosage par rapport à sa charge électronique
9 – Le potassium :
Tout comme le Sodium, le Potassium est un sel qui se trouve dans tous les liquides sous formes de cations et joue un rôle couplé avec le sodium. Son unité de dosage est l’équivalent gramme. Le taux normal de Potassium dans le sérum est de 3,9 meq/l à 5,5 meq/l.
L’ionogramme sanguin est le taux de Potassium, de Sodium et de Chlore.
Le taux normal de chlore est 95 – 102 meq/l
103 [Na+]
NB : Calcul du chlore : [Cl] =
143
LES BASES D’APPRECIATION D’UN REACTIF
1 - Les critères de choix d’un réactif
Ils sont basés sur :
- la sensibilité du réactif
- la spécificité du réactif
- la stabilité du réactif
- la fiabilité du réactif
2- Les critères de résolution du choix d’un réactif
Les critères de résolution pour les délégués sont :
- la mobilité du stock du réactif
- la facilité d’exécution des tests (le test doit être peu exigeant, ne demandant pas assez de moyens techniques.) (1)
Pour les techniciens
il doit être adapté à leur laboratoire (conditionnement) en plus du critère (1)
VII Performance d’un réactif
La performance d’un réactif se calcule en choisissant un réactif comme référence : c’est-à-dire un réactif de même nature et connu pour ses bons résultats.
Un minimum d’analyses doit être fait sur un panel de 100 échantillons pour permettre de calculer de manière numérique les critères de choix.
Calcul des performances d’un réactif:
1 Nn
• Sensibilité : S = avec is =
1 + is Np + Nc
is : gradient d’insensibilité (is < 1)
Np : nombre de tests donnant le même résultat que le référentiel.
Nn : Nombre de tests ne donnant pas les mêmes résultats que le test référentiel
Nc : Nombre corrompu : nombre de tests donnant approximativement le même résultat que le référentiel.
Exemple : Np = 5 ; Nn = 2 ; Nc = 3
S = 80%
Np
• Spécificité : Sp = S x
Np + Nc
1 NE
• Stabilité : St = avec ist =
1 + ist NS
Ist : gradient d’instabilité (ist< 1)
NE : nombre de test n’ayant pas réagi à la date de péremption
NS : nombre de test ayant réagi à la date péremption
• Fiabilité : fi = S x Sp
• Indice de choix : ic = S x Sp x St
2 Kouame Tiemele Le 29/03/2009
CARACTERISTIQUES
Cas du WIDAL & FELIX
Le WIDAL & FELIX est un test sérologique rapide, sur plaque et en tube :
PRINCIPE
Conditionnement d’une réaction antigène- anticorps visible à l’œil nu grâce à la combinaison préalable anticorps particules. La réaction est perçue sous forme d’agglutinats. C’est un test très sensible mais spécifique à 50- 80% .Il est constitué de deux types d’antigènes :
- Antigène somatique O (antigène de paroi)
- Antigène flagellaire H (antigène de flagelle)
Dans l’ordre d’apparition des anticorps après contage, les anticorps anti-antigènes somatiques O sont les premiers à apparaître, ensuite, les anticorps anti-antigènes flagellaires H apparaissent
L’ordre d’apparition des anticorps permet de faire une interprétation des résultats.
Les tests de WIDAL & FELIX rapides sont des tests à conservation facile, (peuvent rester plus d’un mois mais à la température du laboratoire sans être détériorés). Comme tout test d’agglutination, il peut être sensible aux secousses.
L’homogénéisation doit se faire par retournements doux.
Présentation du test : 8 tests sérologiques +2 tests de contrôle (- /+)
conditionnalités de réalisation des tests
Toute induction d’anticorps respecte un moment d’incubation. La progressivité de cette induction, rallonge la période de détectabilité des anticorps.
Ainsi, le WIDAL & FELIX est négatif dans la première semaine du contage.
Anticorps anti salmonelle Période de l’apparition d’anticorps Pic d’anticorps Titre significatif
AO, BO, CO
T O
D
1- 2 semaines
3-5 semaines
1 / 100
AH , BH , CH
TH , HD
2-3 semaines
4-5 semaines
1/200
Les plaques et les tubes de réactions doivent être secs et propres pour éviter les
fausses réactions. Il n’est pas conseillé d’utiliser le WIDAL & FELIX pour les contrôles après traitement. A cause du mémoire immunologique, les résultats après traitement sont ininterprétables. Les tests ne doivent pas être réalisés sur du sérum hémolysé pour éviter les fausses réactions, en général les réactions sont inhibées dans le cas des sérums hémolysés.
Tous les résultats positifs doivent être testés par la technique en tube.
Utilisation des réactifs
Après environ 30mn à la température du laboratoire, les réactifs peuvent être utilisés après suspension par retournements doux.
Micro titrage sur plaque
C’est une technique délicate qui demande une maîtrise spéciale.
On distribue le diluant sur la plaque, on procède par dilutions progressives du sérum en partant de la première goutte de diluant à la dernière.
Cette première série de dilutions permettra de déterminer le titre brut. Ce titre est l’inverse de la dernière dilution donnant une agglutination.
Le titre définitif est donné par le produit du titre brut par le seuil de positivité
Ex : soit 1/16 la dernière dilution donnant une agglutination après ajout du réactif
T : 16
Soit S : 20 ui /ml, seuil de positivité du réactif inscrit sur la boîte ou dans la notice.
Tf : 20x16 : 320 ui /ml
Dans le cas du WIDAL TECO, on fera une agglutination sur plaque pour le test qualitatif.
Le test quantitatif est fait par dilution en tubes.
Procédure
Micro titrage sur plaque
1-Mettre une série de gouttes d’environ 50ul de diluant sur la plaque.
2- Ajouter 50ul de sérum à la première goutte.
3- Homogénéiser par pipetage et prélever 50ul pour la goutte de diluant suivante, répéter le geste jusqu’à la fin des gouttes et rejeter 50ul.
Les dilutions obtenues sont : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128….
On testera chaque dilution par apport de réactif dans le milieu réactionnel.
On déterminera le titre brut puis le titre définitif.
Titrage sur plaque
50 ul 50 ul 50 ul 50 ul
Diluant : 50ml 50ul 50 ul 50 ul
Dilution : 1/2 1/4 1/8 1/1
Titre brut 2 4 8 16
Titre définitif: 2.S 4.S 8.S 16.S
NB- Le titre brut est l’inverse du taux de dilution ayant réagi.
Le titre définitif est le produit du seuil par le titre brut.
Micro titrage en tubes
Procédure :
Les dilutions successives et progressives se font dans des tubes à hémolyse.
Selon le test, on définira une dilution de départ. A partir de cette dilution, on procédera par des dilutions progressives. Au niveau de la dilution en tube, il n’existe pas de titre définitif, vu l’importance des dilutions la solution réactive ne les modifie pas.
Le titre brut est le seul à noter.
50ul 50 ul 50 ul 50 ul 50 ul 50 ul
1/80 50 50 50 50 50 50
Dilution 1/2x80 1/160x2 1/320x2 1/640x2 1/1280x2 1/2560x2
Titre 160 320 640 1280 2560 5120
Interprétation
Voir fiches techniques ou fiches de résultats.
Observations : on notera toutes les remarques : hémolyse, insuffisance de sérum, sérum vieilli (+2 jours au réfrigérateur)
FICHE DE COMMANDE CLIENT
Etablissement : Date de commande :
Adresse : Date limite de recevabilité :
Service :
Paillasse :
Code Qtité Désignation Condition-
nement Méthode Long
D’onde Observation
TECHNICIEN RESPONSABLE DE LABORATOIRE
FICHE DE RENSEIGNEMENT ENTREPRISE
Etablissement : Date :
Adresse : Type d’appareil :
Service :
Paillasse
N° DESIGNATION METHODE CODE CONDITI Long
D’onde
lecture OBSERV
TECHNICIEN INVESTIGATEUR
FICHE DE LIVRAISON ENTREPRISE
Etablissement : Date de livraison :
Adresse : Date limite de paiement :
Service :
Paillasse :
N° Code Qtité Désignation Date de
pérempt Prix
Unit Mtant Observ
Total :
Client Entreprise Date
3 ouafia Le 16/05/2010
EST CE QUE cette methode est juste: A2-A1=x
A3-A2=y X+Y=B B fois 1750=?
JE LIs A1.A2.A3 apres a intervalle de 3 min
4 Tiemele Le 18/05/2010
5 DAGUIA John Clotaire Le 10/06/2010
6 ONDENOT Le 23/06/2010
7 kouame tiemele Le 26/06/2010
concernant l'epreuve de Widal en test rapid sur plaque, la contre epreuve ou de confirmation doit se faire en tubes. la coproculture pourrait etre un tres bon test de contre epreuve puisqu'il resoud le probleme de fenetre d'incubation se situant avant la premiere semaine de contage infectieux. merci, votre serviteur Tiemele Kouame
8 TALLA CLOVIS Le 28/06/2010
9 TIEMELE Le 13/07/2010
Le control de la Qualite est un systeme valide par un service competent permettant de s'assuerer de la conformite des resultats delivres.
10 foku aimé Le 18/01/2011
11 lubaki Le 04/11/2011
12 razak Le 02/02/2012
13 kouame tiemele Le 05/03/2012
On peut également faire une coprocuture sur milieu SS.
A M. Razak, les protocoles de dosage des enzymes sont fournis par les fabricants des réactifs. On les trouve dans les coffrets.
14 mireille kapinga Le 08/05/2012
15 Tiemele Kouame Le 18/06/2012
- les anticorps somatiques O qui apparaissent environ une semaine apres le comtage. Ils sont de type Igm et disparaissent quelques semaines sans ou avec traitement
- les anticorps flagellaires qui apparaissent deux semaines environ apres le comptage. Ils sont de type IgG. Ce sont des anticorps memoire. Ils peuvent apparaitre apres une vaccination. Ils persistent apres traitement d'un malade. l'interpretation du Widal est delicate. Il n'est pas indiqué dans les controles apres traitements. Les resultats sont ininterpretables apres traitement.
16 badaoui walid Le 01/08/2012
17 DJONA LONA Le 16/08/2012
18 replica watches Ged Le 21/08/2012
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65 gry online Aboms618 Le 25/10/2012
66 mohamed Le 30/10/2012
je veux savoir comment est ce que en peut utilise tube sec pour touts les test biochimique et sérologiques
pourqoi en centrifugue le prélevement rapidement juste après on reçu
merci
67 tiemele Le 27/11/2012
68 tiemele Le 27/11/2012
69 Tiemele Le 19/12/2012
70 Tiemele Le 23/01/2013